l cambiamento climatico che si sta verificando a livello globale sta modificando in Europa l’insorgenza delle malattie infettive, in particolare quelle trasmesse da vettori. Il clima umido e le lunghe stagionalità calde hanno aumentato la presenza, nel territorio europeo, di alcuni vettori come le zanzare. Si registra, di conseguenza, anche un aumento del rischio di diffusione di virus trasmessi dalle zanzare e di malattie che un tempo erano tipiche delle zone umide.
Ne è un esempio emblematico la West Nile Disease (WND). Sulla base dei dati collezionati dal Centro Europeo per la Prevenzione e il Controllo delle Malattie (ECDC), nel 2023 si sono registrati in Europa 707 casi di WND provenienti da 9 diversi paesi e 67 decessi. L’Italia, per la sua posizione a ponte tra Nord Africa ed Europa, è particolarmente interessata da questi cambiamenti ambientali e scopo del presente articolo e quello di fornire una descrizione esaustiva della WND unitamente a un aggiornamento relativo alla situazione epidemiologica in Italia.
Definizione di West Nile Disease
La West Nile Disease (WND) è una malattia infettiva non contagiosa trasmessa tramite insetti ematofagi. Lo spettro d’ospite del virus comprende diverse specie di vertebrati, quali mammiferi, uccelli e rettili. Generalmente l’infezione decorre in modo asintomatico o con sindromi simil-influenzali, ma si rende anche responsabile di forme di meningoencefalite negli uccelli, negli equidi e nell’uomo.
Il virus e stato isolato per la prima volta nel 1937 in Uganda dal sangue di una donna con sintomatologia febbrile, proveniente dal distretto di West Nile. Attualmente il virus della WND (WNV) e diffuso in Africa, Medio Oriente, Nord America, Asia Occidentale ed Europa, dove e stato segnalato a partire dal 1958.
Eziologia: il WNV
L’agente eziologico della West Nile Disease è un arbovirus (Arthropod-Borne Viruses). Questa classificazione non ha un valore tassonomico ma include questa patologia nel complesso delle infezioni virali mantenute in natura mediante la trasmissione tra ospiti vertebrati a mezzo di artropodi ematofagi.
Il WNV appartiene alla famiglia Flaviviridae, genere Orthoflavivirus, specie Orthoflavivirus nilense, ed è stato sierologicamente classificato all’interno del complesso delle encefaliti giapponesi, unitamente all’encefalite della Valle del Murray (Murray Valley Encephalitis, MVE), all’encefalite di Saint Louis (Saint Louis Encephalitis, SLE), ai virus Kunjin (KUNV), Usutu (USUV), Koutango (KOUV), Cacipa-core (CPCV), Yaounde (YAOV) e Alfuy (ALFV). Ad eccezione di WNV e USUV i restanti virus non sono stati ad oggi segnalati in Europa.
Il WNV è un virus, provvisto di envelope, con virione a simmetria icosaedrica dal diametro approssimativo di 45-50 nm. Il genoma e costituito da RNA a singolo filamento a polarità positiva, della lunghezza di 11 kb, ed è organizzato in un singolo Open Reading Frame (ORF) che codifica per una poliproteina che viene poi scissa dalle proteasi cellulari e virali in 11 proteine virali costituite da tre proteine strutturali, la proteina capsidica (C), la proteina di membrana (prM) e la proteina dell’envelope (E) e sette proteine non strutturali (NS). Le proteine dell’envelope (E) e di membrana (prM), sono responsabili di proprietà del virus quali lo spettro d’ospite, il tropismo tissutale, la replicazione, e la stimolazione della risposta immunitaria.
Da Saiz et al., 2021.
In base alla biologia, all’evoluzione, alla patogenicità e alla distribuzione geografica, i ceppi di WNV sono stati suddivisi in nove gruppi che prendono il nome di lineages. I ceppi di WND responsabili di gravi epidemie sono attribuibili al lineage 1 e al lineage 2. Le analisi filogenetiche hanno evidenziato come i ceppi circolanti in Europa appartenenti ai lineages 1 e 2 provengono da un numero limitato di introduzioni indipendenti, molto probabilmente dall’Africa, seguite da diffusione ed endemizzazione locale.
Da Saiz et al., 2021.
Epidemiologia
La presenza di anticorpi specifici nei confronti del WNV e stata identificata in uccelli, equidi, anfibi, rettili e uomo. L’ampio host range testimonia la grande capacita del virus di infettare un elevato numero di specie. Tuttavia, i vertebrati che rivestono un ruolo rilevante nell’epidemiologia della WND sono gli uccelli, gli equidi e l’uomo.
Gli uccelli fungono da serbatoio naturale del WNV e rappresentano i principali ospiti vertebrati del virus. Infatti, l’agente eziologico è stato identificato in più di 150 specie di uccelli. In particolare, i principali ospiti reservoir sono i Charadriiformes (gabbiani, storni, beccacce e chiurli) e i Passeriformes, tra i quali particolare importanza nell’ecologia del WNV rivestono soprattutto i Ploceidae (passeri), gli Sturnidae (storni) e i Corvidae (gazze e cornacchie) i quali presentano elevati livelli di viremia e di lunga durata.
Il principale meccanismo di contagio del WNV è rappresentato dalla trasmissione tramite vettori, per il quale viene riconosciuto un ciclo endemico e un ciclo epidemico. Nel ciclo endemico, il WNV si mantiene in natura mediante un ciclo primario zanzara-uccello-zanzara. Le zanzare ornitofile adulte, che rappresentano i vettori, si infettano pungendo uccelli viremici, che sono gli ospiti amplificatori. Il virus, una volta ingerito, e in grado di diffondere nell’organismo della zanzara, dove si moltiplica e si localizza a livello delle ghiandole salivari per poi essere trasmesso all’ospite vertebrato.
Il ciclo primario zanzara-uccello-zanzara è suddiviso a sua volta in un ciclo rurale e/o selvatico, che si istaura in prossimità delle zone umido-paludose, tra uccelli acquatici selvatici e zanzare ornitofile e in un ciclo sinantropico e/o urbano che si verifica tra gli uccelli sinantropici o domestici e le zanzare che possono effettuare il pasto di sangue sia sugli uccelli sia sull’uomo.
Per quanto riguarda il ciclo epidemico o secondario, quest’ultimo si realizza nell’eventualità dell’inserimento di ospiti accidentali, quali il cavallo e l’uomo, nel ciclo di trasmissione. Questi ospiti contraggono la malattia da vettori artropodi, definiti come “vettori ponte”, in grado di trasmettere il WNV a ospiti diversi dai volatili. Gli equidi e l’uomo sono considerati ospiti accidentali o ospiti terminali dell’infezione e a fondo cieco epidemiologico. Difatti, nel circolo sanguigno di questi ospiti, il virus non raggiunge titoli virali sufficientemente elevati da infettare i vettori e, pertanto, il ciclo di trasmissione non riesce a perpetuarsi.
Riguardo i vettori, il WNV ha la possibilità di essere trasmesso da differenti generi e specie di zanzare. Ad oggi, il virus e stato isolato in almeno 65 specie, di cui circa una dozzina sono presenti in Italia. Le specie di vettori principalmente responsabili della diffusione della malattia sono: Culex pipiens, Ochlerotatus caspius, Anopheles maculipennis e Aedes albopictus e vengono considerate come specie ornitofile. Le specie “vettori ponte” di WNV sono: Culex pipiens, Culex modestus, Ochlerotatus detritus, Culiseta annulata e Aedes albopictus.
La WND presenta una caratteristica stagionalità, correlata alla circolazione dei vettori, che nelle zone temperate interessa la tarda estate e l’inizio dell’autunno con un apice nella seconda metà d’agosto, mentre nelle aree subtropicali e tropicali la trasmissione del virus e possibile durante tutto l’arco dell’anno. Nella maggior parte dei casi, il virus viene introdotto in nuove aree dagli uccelli migratori. Questi ultimi, in qualità di animali serbatoio in fase viremica, causano l’infezione di vettori che potranno trasmettere il WNV ad altri uccelli, per lo più stanziali, favorendo lo stabilirsi di un ciclo locale che, in particolari condizioni eco climatiche, può amplificarsi fino a dare origine a vere e proprie epidemie.
Dunque, è frequente che il maggior numero degli episodi di malattia si manifesti in aree umide o in vicinanza delle foci dei fiumi dove si verifica la sovrapposizione dell’home range tra avifauna stanziale e migratoria e la concomitante presenza di alte densità di insetti vettore.
È da notare come sia stata dimostrata in alcune specie di vettori la possibilità di trasmissione trans-ovarica del WNV. Tale meccanismo, unitamente alla possibilità di superare l’inverno in ospiti a lunga viremia o in zanzare adulte infette svernanti, permetterebbe la sopravvivenza invernale (overwintering) del virus, aumentando la probabilità di endemizzazione dell’infezione in un territorio.
Ulteriori modalità di diffusione di WNV sono state evidenziate. È stato infatti dimostrato che il WNV è infettante per via orale ed è stato identificato in tamponi orali e cloacali collezionati da uccelli infetti. Anche nei rettili, è stata dimostrata la possibilità di trasmissione per via orale e si ritiene, che in virtù della lunga viremia riscontrata in tali specie, possano avere un ruolo nell’epidemiologia della WND. Infine, nell’uomo oltre che attraverso la trasmissione vettoriale, la diffusione del WNV e stata dimostrata in caso di emotrasfusioni, trapianti d’organo, trasmissione transplacentare o attraverso il latte materno.
Da Schwarz et al., 2023.
West Nile Disease in Italia
Per quanto riguarda l’Italia, il primo focolaio di WND risale al 1998, in Toscana, dove sono stati registrati casi clinici di WND in cavalli stabulati nell’area circostante il Padule di Fucecchio. Nell’agosto del 2008, dopo 10 anni dalla prima segnalazione, la WND è stata evidenziata in altre tre regioni: Emilia-Romagna, Lombardia e Veneto, nell’area del delta del Po, con casi clinici negli equidi e nell’uomo ma con assenza di casi clinici nei volatili. Da tale anno la malattia può essere considerata endemica in alcune aree del territorio nazionale e in continua evoluzione epidemiologica, così come in Europa e nel Bacino del Mediterraneo.
Sulla base dei più recenti dati collezionati dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise, centro di Referenza Nazionale per le Malattie Esotiche degli animali (CESME), nel 2023 sono stati segnalati in Italia 332 casi confermati di infezione da WNV nell’uomo. Di questi, 190 casi si sono manifestati nella forma neuroinvasiva, 71 sono stati i casi asintomatici identificati in donatori di sangue, 70 i casi di febbre e un caso asintomatico.
La sorveglianza veterinaria attuata su cavalli, zanzare, uccelli stanziali e selvatici, ha confermato la circolazione del WNV lineage 2 in Emilia-Romagna, Friuli-Venezia Giulia, Sicilia, Liguria, Marche, Veneto, Lombardia, Sardegna, Piemonte e Puglia. Inoltre, il WNV lineage 1 è stato identificato in Emilia-Romagna, Sicilia, Veneto e Campania.
Sempre nel 2023, il CESME ha confermato 23 focolai clinici negli equidi in Puglia, Piemonte, Basilicata, Sardegna, Sicilia, Campania, Veneto, Liguria ed Emilia- Romagna (dati CESME, IZSAM).
Patogenesi
In seguito alla puntura da parte del vettore portatore del WNV, si ha un’iniziale replicazione virale nei tessuti locali e nei linfonodi regionali, in particolare nei cheratinociti, nelle cellule di Langerhans e nelle cellule dendritiche. Segue una viremia primaria, che interessa il sistema reticolo-endoteliale a cui può seguire una viremia secondaria con eventuale localizzazione a livello del sistema nervoso centrale.
Il livello della viremia è il risultato di fattori virus-specifici e ospite-specifici e condiziona le manifestazioni cliniche e l’evoluzione della malattia. Uno dei fattori virus-specifici è la proteina E dell’envelope virale, che sembra essere un fattore primario di virulenza e media l’interazione virus-cellula ospite condizionandone la neuroinvasivita. I fattori ospite-specifici, che facilitano l’ingresso di WNV nel SNC, rimangono sconosciuti; tuttavia, questo processo sembra essere favorito dalla presenza di patologie che compromettono l’endotelio cerebrale, sito di replicazione del virus, quale l’ipertensione e le patologie cardiovascolari, oppure patologie che prolungano la fase viremica come l’immunodepressione.
Ulteriori ipotesi sulle potenziali modalità di penetrazione del virus nel SNC comprendono la diffusione passiva attraverso l’endotelio dei capillari, la replicazione virale nelle cellule endoteliali e nel parenchima del SNC, e il trasporto retroassonale del virus da parte di neuroni infetti dell’epitelio olfattorio.
Sintomi e lesioni
Uccelli
Negli uccelli, la malattia è caratterizzata da un periodo di incubazione di 3-4 giorni e, in genere, decorre in forma asintomatica o subclinica. La sintomatologia comprende: atassia, paralisi, movimenti di maneggio, pèdalage, torcicollo, opistotono, incoordinazione motoria, depressione, letargia, penne arruffate e perdita di peso. Nella maggior parte dei casi, l’animale giunge a morte 24 ore dopo l’esordio dei sintomi neurologici.
Equidi
Negli equidi, il periodo di incubazione è pari a 3-15 giorni. Circa il 90% dei cavalli infetti da WNV sono asintomatici ma alcuni sviluppano segni neurologici, spesso accompagnati da diminuzione dell’appetito e depressione. La febbre si osserva nella maggioranza dei casi e può scomparire prima della comparsa dei segni a livello del sistema nervoso centrale.
I segni neurologici possono includere atassia, deficit propriocettivi, paralisi di uno o più arti, movimenti in circolo, impossibilità a mantenere la stazione quadrupedale, debolezza degli arti posteriori, fascicolazioni cutanee, tremori e rigidità muscolare, talvolta dismetria, sonnolenza, ipereccitabilità o aggressività, iperestesia, ptosi del labbro inferiore, o paresi dei muscoli labiali o facciali, digrignamento dei denti, paralisi/paresi agli arti, fino ad arrivare alla paralisi generalizzata.
Nel cavallo sono stati documentati anche enterocoliti, occlusioni del colon, prolasso rettale e disordini urinari. In un asino è stata segnalata un episodio di epatite fatale accompagnata da sintomi a carico del sistema nervoso centrale. La guarigione può avvenire in 5-15 giorni oppure l’animale va incontro a morte nel 22-45% dei casi.
La malattia negli equidi determina scarse lesioni evidenziabili macroscopicamente, per lo più sotto forma di microemorragie a carico del sistema nervoso centrale; queste ultime lesioni si presentano istologicamente sotto forma di encefalomielite non purulenta, localizzata soprattutto a livello di tronco cerebrale e midollo spinale.
Uomo
La maggior parte casi di infezione da WNV decorre in modo asintomatico. Il periodo di incubazione dura generalmente 2-14 giorni, ma in pazienti immunocompromessi sono stati osservati periodi di incubazione prolungati fino a 21 giorni. I quadri clinici associati all’infezione possono essere di varia entità. Sono state osservate sia lievi sindromi simil-influenzali autolimitanti che forme debilitanti della durata di settimane o mesi.
L’insorgenza dei sintomi è improvvisa, spesso vengono riscontrati mal di testa, malessere, febbre, mialgia, brividi, vomito, eruzione cutanea, affaticamento e dolore agli occhi. Le forme neuroinvasive si manifestano in meno dell’1% dei casi. Il WNV può provocare meningoencefaliti che solitamente si manifestano con rigidità nucale, fotofobia, letargia o paralisi flaccida acuta.
La mortalità è più elevata in soggetti immunocompromessi o anziani. Nei pazienti con un’età uguale o superiore a 70 anni sono stati osservati percentuali di mortalità compresi tra l’0,8% e il 17%.
Le lesioni anatomo-patologiche sono riconducibili a foci necrotici con infiltrazione di leucociti polimorfonucleati e macrofagi a livello di sistema nervoso, fegato e cuore.
Diagnosi nell’equide
Il sospetto diagnostico di WND è formulato quando, nel periodo di attività degli insetti ematofagi, gli equidi presenti in aree a rischio presentino morte improvvisa e/o sintomi neurologici riconducibili ai quadri clinici precedentemente descritti. La diagnosi differenziale è da porre principalmente nei confronti delle encefaliti equine sostenute da alfavirus, dall’herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1), della mieloencefalite protozoaria equina (EPM), della rabbia, del botulismo, delle mieliti batteriche o micotiche; anche se è da rilevare che le encefaliti da alfavirus e l’EPM sono malattie esotiche non presenti in Italia mentre la rabbia è attualmente eradicata nel territorio nazionale.
Per questi motivi, i criteri diagnostici devono includere una combinazione di valutazioni cliniche e prove di laboratorio. Queste ultime sono rese particolarmente complesse da fattori quali la grande variabilità del genoma del WNV o la cross-reattività degli anticorpi con altri flavivirus. La viremia transiente e il basso titolo virale sviluppato, negli equidi e nell’uomo, durante l’infezione rappresentano ulteriori ostacoli alla diagnosi che proprio per questi motivi deve essere eseguita da laboratori specializzati.
Secondo le linee WOAH, la diagnosi di laboratorio della WND può essere fatta direttamente dal sangue o dagli organi bersaglio, o indirettamente, attraverso l’uso di test sierologici per la ricerca di anticorpi specifici.
La diagnosi diretta si basa sull’identificazione del WNV, dei suoi antigeni o dell’RNA a partire da sangue in EDTA, cervello, midollo spinale e fluido cerebrospinale. I saggi diagnostici utilizzati sono l’isolamento virale su colture cellulari, l’immunofluorescenza, l’immunoistochimica, la RT-PCR e la real time RT-PCR.
L’isolamento virale viene effettuato su differenti cellule primarie e linee cellulari di mammiferi (VERO, BHK21 e RK13), tuttavia sono necessari vari passaggi per rilevare l’effetto citopatico (CPE) e la conferma della presenza del virus e effettuata tramite il test di immunofluorescenza o attraverso le metodiche immunoenzimatiche.
Sugli stessi campioni biologici possono essere anche eseguite tecniche di biologia molecolare per evidenziare l’RNA virale mediante RT-PCR o real time PCR. È da notare come la PCR da campioni ematici sia frequentemente negativa in virtù della breve durata della viremia, che solitamente non è più rilevabile all’insorgenza dei sintomi clinici.
Per quanto riguarda la diagnosi indiretta descritta dalla WOAH, la presenza di anticorpi nei confronti del WNV può essere svelata, a partire da campioni ematici, utilizzando test sierologici quali l’ELISA IgM, l’ELISA IgG, la sieroneutralizzazione virale in micrometodo e il test di riduzione del numero delle placche. I saggi immunoenzimatici (ELISA) hanno trovato largo impiego negli ultimi anni, in virtu della loro grande specificità e sensibilità, nonché per la loro rapidità di esecuzione.
Tuttavia, uno dei principali limiti dei test ELISA è la possibile cross-reattività con altri flavivirus appartenenti allo stesso gruppo antigenico, come ad esempio il virus Usutu (USUV), date le strette relazioni antigeniche esistenti fra i membri di questa famiglia. Per questa ragione è necessario confermare la positività ottenuta al test ELISA ricorrendo a un test di neutralizzazione virale.
Misure di profilassi, prevenzione e controllo
Disinfezione
Il WNV viene rapidamente inattivato nell’ambiente esterno. È inattivato dal calore (da 50 a 60°C per almeno 30 minuti), dalla luce ultravioletta e dall’irradiazione gamma. Il virus è anche sensibile ai disinfettanti come glutaraldeide al 2%, perossido di idrogeno dal 2 al 3%, da 500 a 5.000 ppm di cloro, alcool, iodio all’1% e iodofori.
Profilassi immunizzante
Nelle aree endemiche, la vaccinazione consente di proteggere dalla malattia i soggetti a rischio e sono stati allestiti diversi tipi di vaccino: un vaccino inattivato, un vaccino vivo ricombinante, un vaccino a DNA e un vaccino chimerico. Attualmente sono autorizzati nella Comunità Europea, e quindi in Italia, tre vaccini (Ordinanza Ministeriale del 5 novembre 2008) indicati per i cavalli di età superiore ai 6 mesi e che garantiscono una copertura immunitaria per 12 mesi. Tale vaccinazione facoltativa è consentita previa comunicazione al Servizio Veterinario dell’ASL competente per territorio e la relativa registrazione dell’avvenuta vaccinazione nel passaporto dell’animale. A oggi non sono disponibili vaccini per uso umano.
Profilassi sanitaria, prevenzione e controllo
La WND oltre ad essere una zoonosi è classificata come malattia di “categoria E” dal Regolamento di esecuzione (UE) 2018/1882. Per questa malattia, il Regolamento (UE) 2016/429 (Animal Health Law) rende necessaria la sorveglianza all’interno dell’Unione, e quindi l’adozione di norme di prevenzione e controllo anche nell’intero territorio italiano.
In Italia, la sorveglianza epidemiologica dei casi umani di WND è regolata dal “Piano Nazionale di prevenzione, sorveglianza e risposta alle Arbovirosi (PNA) 2020-2025” sottoscritta dalla Conferenza Stato, Regioni e Province autonome il 15 gennaio 2020. Il documento integra in un unico Piano la sorveglianza dei casi umani segnalati e la sorveglianza veterinaria che prevede l’esecuzione di attività di sorveglianza sierologica su uccelli stanziali appartenenti a specie bersaglio; sorveglianza clinica e sierologica negli equidi; sorveglianza entomologica e la sorveglianza su carcasse di uccelli selvatici.
Nei Paesi dove la malattia è endemica, l’obiettivo principale è la riduzione della circolazione virale. Tuttavia, le caratteristiche epidemiologiche del virus e la distribuzione mondiale della malattia fanno dei Paesi in cui l’infezione non è endemica territori costantemente a rischio e, per tale ragione, è fondamentale la realizzazione di sistemi d’allerta rapida e piani di sorveglianza integrata che, fornendo precocemente informazioni sulla circolazione virale, rendono possibile l’attuazione delle misure preventive. A tal fine è cruciale che vengano messe in atto strategie integrate volte alla riduzione della circolazione del virus attraverso misure che agiscano sulla densità dei vettori e che riducano le possibilità di contatto tra vettori e ospiti recettivi.
Le misure di controllo sugli insetti ematofagi si basano prevalentemente sulla ricerca e la rimozione dei focolai di sviluppo larvale, la bonifica ambientale e l’impiego di prodotti larvicidi nei focolai che non possono essere rimossi o bonificati. I focolai piu comuni possono essere di vario tipo, ad esempio: acquitrini, canalizzazioni a cielo aperto, bacini perenni, risaie, cisterne e depuratori. Lo sviluppo delle forme larvali è favorito soprattutto laddove le acque sono ferme e contengono detriti vegetali che forniscono nutrimento e riparo.
Inoltre, al fine di minimizzare il rischio di infezione bisognerebbe adottare misure di protezione individuale che limitino il contatto uomo-vettore quali l’utilizzo di un abbigliamento idoneo che lasci scoperte il minor numero possibile di zone corporee, l’utilizzo di presidi medico-chirurgici insetto-repellenti per uso topico ed evitare l’ingresso delle zanzare nelle abitazioni mediante zanzariere a maglie fitte (PNA 2020-2025).
Infine, nelle aree con dimostrata circolazione virale vengono applicate tutte le misure finalizzate a limitare il rischio di trasmissione diretta all’uomo del WNV mediante trasfusioni di sangue e trapianti di organi e tessuti. In Italia, il Centro Nazionale Sangue e il Centro Nazionale Trapianti garantiscono la sicurezza delle procedure connesse a trasfusioni e trapianti grazie al costante monitoraggio dell’andamento dell’infezione in Italia e nel Mondo e la conseguente applicazione di idonee misure di screening.
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